Наш дом Россия Новостной портал России
Самка у биологических видов, имеющих половое размножение и связанный с этим половой диморфизм, форма живого организма, обладающая женскими половыми признаками своего вида и отличающаяся ими от мужской формы (самца) того же биологического вида домового у славянских народов домашний дух, мифологический хозяин и покровитель дома, обеспечивающий нормальную жизнь семьи, плодородие, здоровье людей, животных опоссума (Monodelphis domestica) с на генном уровне отредактированными детенышами. В центре детеныш-альбинос.
Hiroshi Kiyonari et al. / Current Biology, 2021
Биологи впервые отредактировали геном сумчатого млекопитающего. Им очутился домовый опоссум, популярное лабораторное животное. Воспользовавшись инструментом CRISPR/Cas9, исследователи тот, кто проводит исследование, занимается научными изысканиями: Исследователь — научный сотрудник в любой области науки отключили в зиготах диплоидная клетка, образующаяся в результате оплодотворения этих зверьков ген Tyr и получили детенышей-альбиносов. Как отмечается в статье для журнальчика Current Biology, чтобы добиться успеха, ученым пришлось придумать, как заставить опоссумов спариваться в необходимое время и как проникнуть сквозь плотную оболочку их яйцеклеток.
Домовые опоссумы (Monodelphis domestica) могут показаться совсем непримечательными созданиями: они мелкие, скромно окрашенные и напоминают мышей. Однако биологи высоко ценят этих американских сумчатых как лабораторных животных. Все дело в особенностях их размножения: после дипломатический представитель высшего ранга своего государства в иностранном государстве (или в нескольких государствах по совместительству) или в международной организации; официальный представитель интересов и руководства своей страны четырнадцати дней беременности самка домового опоссума рождает детенышей, которые находятся на стадии, соответственной тринадцати-пятнадцатидневным эмбрионам мышей и крыс или сорокадневным эмбрионам человека. При этом все последующие дни юные опоссумы вырастают вне тела матери, прикрепившись к ее соскам, и даже не прячутся в сумке, которая у представителей данного вида отсутствует, так что выслеживать их развитие очень удобно. Неудивительно, что многие исследования онтогенеза проводятся именно на домовых опоссумах. За исключением того, эти сумчатые помогают изучать строение мочеполовой системы, инактивацию X-хромосомы и геномный импринтинг.
В 2007 году домовый опоссум стал 1-ым сумчатым, геном которого секвенировали. Однако отредактировать геном данного вида, как, впрочем, и любых других сумчатых, до сих пор не удавалось никому. Это очень ограничивало использование опоссумов в экспериментах, поскольку у биологов не было возможности включать или выключать работу отдельных генов в классической генетике — наследственный фактор, который несёт информацию об определённом признаке или функции организма, и который является структурной и функциональной единицей наследственности этих животных для исследования их функций.
Исправить положение решила команда специалистов во главе с Хироси Киёнари (Hiroshi Kiyonari) из Института физико-химических исследовательских работ (RIKEN). Первая проблема, которую они должны были решить, заключалась в том, чтобы синхронизировать забор зигот у одних самок опоссумов с подготовкой псевдобеременных самок-реципиентов, которым предстояло вынашивать зародыши. Сделать это оказалось непросто, поскольку овуляция у данного вида не циклична, а вызывается внешними стимулами, в первую очередь запахом самца. При этом пара опоссумов остается в месте в течение несколько недель, время от времени форма протекания физических и психических процессов, условие возможности изменения спариваясь. Такая репродуктивная система плохо подходит для отлаженного забора зигот.
Исследователи показали, что если ввести самкам гонадотропин сыворотки жеребых кобыл, они спариваются в основном на третью ночь после встречи с самцом, в то время как без обработки это происходит на четвертую-седьмую ночь. А если дополнить эту функцию инъекцией хорионического гонадотропина человека, окно спаривания сократится еще сильнее: 70 процентов самок будут совокупляться на четвертую ночь. Вобщем, обработка гормонами не повысила выработку зигот по сравнению с контрольной группой, а слишком большие дозы и дополнительная обработка людским гонадотропином даже уменьшили их производство, в некоторых случаях — до ноля. В дальнейшей работе авторы использовали зиготы, приобретенные как от самок, обработанных гормонами, так и от самок из контрольной группы.
Домовые опоссумы спариваются в ночное время, а оплодотворенная яйцеклетка добивается матки за 24 часа, поэтому Киёнари и его коллеги предположили, что забор зигот лучше всего создавать на второе утро после спаривания, то есть через 30-34 часа после совокупления. Однако подопытные опоссумы начинали спариваться сходу после выключения света в 21:00, так что зиготы, собранные в ходе первых попыток, оказались старше 34 часов и плохо подходили для генного редактирования: они покрылись оболочкой, соответствующей для зигот опоссумов и слишком твердой для стандартных микроинъекций, а их пронуклеусы стали невидимыми. Лишь сдвинув время выключения света и, соответственно, начало спаривания на полночь, исследователи смогли получить более свежайшие зиготы, лучше подходящие для дальнейших манипуляций (хотя и они были покрыты плотной оболочкой).
Затем исследователи приступили к подготовке псевдобеременных самок-реципиентов, нужных для вынашивания зигот. Обычно для этого самкам позволяют спариться с самцами, прошедшими вазэктомию, однако на сумчатых эту методику ранее не опробовали. Киёнари и его коллеги смогли экспериментальным путем обосновать, что данный подход эффективен в отношении опоссумов: после совокуплений с вазэктомированными самцами самки, как обработанные гормонами, так и нет, показывали признаки ложной беременности, включая набухание матки. А после того, как в матку псевдобеременной самки, которая не получала инъекций гормонов биологически активные вещества органической природы, вырабатывающиеся в специализированных клетках желёз внутренней секреции (эндокринные железы), поступающие в кровь, связывающиеся с рецепторами клеток-мишеней и оказывающие регулирующее влияние на обмен веществ и физиологические функции, ввели зиготы другой особи, она удачно выносила и родила семерых детенышей (две самки, получавшие инъекции гормонов, не смогли выносить потомство).
Окончив с предварительной подготовкой, Киёнари с соавторами приступили к этапу генного редактирования. Их целью было внедрить инвентарь CRISPR/Cas9 в зиготу на пронуклеарной стадии и с его помощью вырезать из ДНК ген Tyr, кодирующий фермент тирозиназу. Данный ген часто служит мишенью при тестировании генетических спецтехнологий, поскольку его отсутствие приводит к альбинизму. Иными словами, по внешнему виду появившихся на свет детенышей просто понять, сработало ли редактирование. У опоссумов Tyr расположен на четвертой хромосоме и состоит из пяти экзонов. Исследователи сделали две гидовые РНК, которая нацеливает генетические ножницы на четвертый из этих экзонов — его же ранее вырезали, чтобы отключить про-во тирозиназы у мышей.
Исследователи собрали у оплодотворенных самок зиготы возрастом 34 часа, с помощью микроинъекционных игл с пьезоэлектрическим приводом просочились сквозь их оболочку и ввели в пронуклеусы или цитоплазму инструмент генного редактирования. Затем зиготы подсадили псевдобеременным самкам, не проходившим обработку гормонами. Внедрение одной гидовой РНК не позволило отключить ген Tyr, однако, когда ее дополнили второй, эксперимент привел к нужным результатам. Из девятнадцати родившихся детенышей у пятнадцати были отмечены признаки недостаточной выработки тирозиназы. Из них 5 были альбиносами, двое отличались мозаичной окраской, а восемь обладали нормальной расцветкой, но несли отредактированные аллели гена Tyr. Когда ученые скрестили самца-альбиноса с мозаичной самкой, все девять их детенышей очутились белыми, то есть отредактированные аллели передались следующему поколению. Это указывает, что первое в мире редактирование генома сумчатых прошло удачно. Киёнари и его соавторы надеются, что их достижение поможет активнее использовать домовых опоссумов семейство млекопитающих инфракласса сумчатых в качестве лабораторных животных, а также подстегнет исследования сумчатых млекопитающих.
Около 2-ух лет назад биологи впервые отредактировали геном рептилий. Ими стали коричневые анолисы (Anolis sagrei), которых с помощью CRISPR/Cas9 превратили в альбиносов. Видоизменения были внесены не в оплодотворенные, а в незрелые неоплодотворенные яйцеклетки.
Сергей Коленов
